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摘要 目的 探讨双氢青蒿素（DHA）对铜绿假单胞菌感染的角膜上皮细胞的清除作用与机制。方法 将热灭活铜绿假单胞菌（MOI=1:100）感染5 h后的人角膜上皮细胞系HCEC细胞分为空白组、不同浓度DHA组(生理盐水预处理30 min后，分别加入10、20、40μmol·L-1 DHA培养24 h)、氯喹（CQ）组(5μmol·L-1 CQ预处理30 min后，加入生理盐水培养24 h)、DHA+CQ组(5μmol·L-1 CQ预处理30 min后，加入40μmol·L-1 DHA培养24 h),采用Western Blot法检测各组细胞微管相关蛋白1轻链3（LC3）、P62、核因子κB（NF-κB）、NF-κB抑制因子α（IκBα）和p-IκBα蛋白表达水平。选取50只6～8周SPF级C57BL6J雌性小鼠构建铜绿假单胞菌角膜炎动物模型，分为假手术组（n=5）、模型组（n=25）、CQ组（n=5）、雷帕霉素组（n=5）、3-甲基腺嘌呤（3-MA）组（n=5）和DHA组（n=5）,除假手术组外，其余5组小鼠在眼表滴加10μL铜绿假单胞菌菌液(107个·mL-1);CQ组、雷帕霉素组、3-MA组、DHA组分别于术前1 d起每日分别用CQ(30μmol·L-1)、雷帕霉素(3μmol·L-1)、3-MA(3 mmol·L-1)、DHA(40μmol·L-1)点眼6次，假手术组和模型组用等体积生理盐水代替；检测各组小鼠模型角膜组织载菌量。结果 10、20、40μmol·L-1 DHA处理均可显著增加HCEC细胞中LC3B-II/LC3B-I蛋白表达比值与IκBα蛋白表达水平，显著降低P62蛋白与p-IκBα蛋白表达水平，且呈剂量依赖性（均P<0.05）;分离胞核和胞质蛋白，DHA处理显著上调细胞质RelA/p65蛋白表达水平并下调核RelA/p65蛋白表达水平（均P<0.05）。与空白组相比，40μmol·L-1DHA组LC3B-II/LC3B-I蛋白表达比值显著升高，CQ组LC3B-II/LC3B-I蛋白表达比值显著降低（均P<0.05）;而DHA+CQ组LC3B-II/LC3B-I蛋白表达比值显著低于DHA组（P<0.05）。TNF-α(100 ng·mL-1)预处理可显著降低DHA组LC3B-II/LC3-I蛋白比值（P<0.05）。在建模24 h后，CQ组和3-MA组小鼠角膜载菌量较假手术组显著增加（均P<0.05）,而雷帕霉素组和DHA组小鼠角膜载菌量与假手术组相比差异无统计学意义（P>0.05）。结论 DHA可通过抑制NF-κB激活进而诱导自噬的机制促进角膜上皮细胞清除铜绿假单胞菌。
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| 关键词 ：
双氢青蒿素,
铜绿假单胞菌,
角膜炎,
自噬,
NF-κB,
动物,
实验,
小鼠
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| 基金资助:四川省卫计委科研课题(19PJ217)； |
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