摘要目的分别构建绿色荧光蛋白(GFP)与氨基端或羧基端缺失突变乙型肝炎病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein,HBx)的重组表达载体,建立稳定表达GFP/HBxn、GFP/HBxc融合蛋白的HepG2细胞系,以进一步研究HBx缺失突变对其生物功能的影响。方法 PCR法分别扩增氨基端缺失50aa的HBx及羧基端缺失50aa的HBx基因,用HindⅢ和KpnⅠ双酶切定向插入pEGFP-C1相应酶切位点并转化宿主菌DH5α,双酶切鉴定pGFP/HBxn、pGFP/HBxc;脂质体转染法转染HepG2细胞,G418筛选出抗性细胞克隆,荧光显微镜下观察GFP的表达,挑选抗性克隆细胞扩大培养并传代。RT-PCR法、Western blot法检测转染细胞HBxn、HBxc基因、蛋白的表达。结果扩增的HBxn、Hbxc基因片段琼脂糖凝胶电泳显示符合预估大小。重组质粒pGFP/HBxn、pGFP/HBxc经HindⅢ和KpnⅠ双酶切后电泳,符合预估大小;转染pGFP/HBxn及pGFP/HBxc的HepG2细胞可见抗性细胞克隆形成,并可见阳性克隆细胞均有GFP表达。RT-PCR与Western blot法检测到HBxn、HBxc的表达。结论成功构建了GFP/HBxn、GFP/HBxc真核重组表达载体pGFP/HBXn、pGFP/HBxc,获得了稳定表达GFP/HBxn、GFP/HBxc融合蛋白的HepG2细胞系,为进一步研究HBx缺失突变对其生物功能的影响奠定了基础。
